前言

HCP ELISA檢測方法必須要通過法規認可的實驗方法（ICH或FDA指南等）進行方法學驗證，以確保其能夠產生準確的結果。想要獲得準確的HCP ELISA檢測結果，本質上是要保證樣品中HCP的濃度高于試劑盒的定量下限（LOQ），同時HCP的檢測抗體還要處于過剩狀態，滿足這兩點就必須要對檢測樣品（過程樣品和最終的藥物原液）進行稀釋線性驗證。因此，稀釋線性（dilution linearity）是驗證HCP ELISA方法特異性和準確性的關鍵實驗之一。在HCP檢測中，稀釋線性不佳的原因主要有兩種：一種是樣品中某些HCPs的抗體過剩條件不滿足，需要通過進一步稀釋來達到“最小必要稀釋倍數”（MRD）；另一種是產品蛋白本身或產品配方緩沖液中的某些成分對HCP的檢測產生干擾，可以采用指定的樣品稀釋液（見文末）或者緩沖液置換等方式處理樣品來滿足檢測需求。關于樣品稀釋液，最優的選擇是使用和標準品相同的稀釋液。Cygnus針對每種ELISA檢測方法都提供了相應的樣品稀釋液，以確保檢測結果的準確性和可重復性。對于使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的用戶，我們建議將可接受的稀釋線性定義為“在兩倍稀釋時，校正后的HCP濃度變化不超過±20%”。同時，還要避免檢測值靠近定量下限，即稀釋樣品HCP檢測值不能低于定量下限的兩倍。接下來，本文將為您詳細解讀HCP ELISA方法學驗證中有關線性稀釋的操作方法與注意事項。

為什么要建立稀釋線性？

在測試一個新的宿主細胞蛋白（HCP）ELISA方法時，建立稀釋線性是第一項基礎實驗，目的是確認所選擇的HCP ELISA是否適用于您的過程樣品和藥物原液中的HCPs。當稀釋線性確認后，它將為進一步的分析驗證提供所需的實驗條件信息，因此稀釋線性通常是最先進行的驗證實驗。

具體來講，稀釋線性實驗的目的是確定ELISA方法對樣品中HCPs的反應曲線和全定量范圍。成功驗證了稀釋線性意味著對存在于該樣品中的各種HCPs，抗體過剩條件已滿足，且樣品基質不會影響HCP的定量，從而保證HCP ELISA檢測結果的可靠性。

如何進行稀釋線性實驗？

在進行ELISA分析之前，任何可能超過定量上限（ULOQ）的樣品都應該先進行稀釋線性實驗。其過程包括：用驗證過的樣品稀釋液對HCP待檢樣品進行多個梯度稀釋，然后對這些稀釋樣品進行檢測，并計算每個稀釋樣品中校正后的HCP濃度（即測得的HCP濃度×稀釋倍數）。大多數情況下，在達到一定稀釋倍數后，稀釋樣品校正后的HCP濃度值會出現相對恒定狀態，那么該稀釋倍數則被稱為“最低需求稀釋度”（MRD）。

圖1 最低需求稀釋度（MRD）

如下表案例，樣品在高濃度（未稀釋和1:2，1:4稀釋）時并未顯示出良好的稀釋線性，但隨著進一步稀釋，我們可以確定一個MRD，即在此稀釋度實現了可接受的稀釋線性（見下表藍色行）。按照定義，當校正后的HCP濃度在2倍稀釋之間的變化范圍不超過±20%時，即達到了可接受的稀釋線性，同時還要避免靠近定量下限，即稀釋樣品HCP檢測值不能低于定量下限的兩倍（在這個案例中1:64稀釋樣品HCP檢測值＜2倍LOQ，因此未計入統計）。變化百分比可以通過減去前一稀釋樣品濃度的校正值，然后將差值再除以前一個稀釋樣品濃度的校正值來計算。例如，1:2稀釋樣品相較未稀釋樣品的變化百分比為：[(233-146)/146]x100%=60%。

從表中數據我們可以得出結論，該樣品的MRD為1:4，那么最終計算出HCP的濃度應在MRD以下（或等于）和LOQ以上所有校正后HCP濃度的平均值（在此例中，應取312、361、356和370的平均值即350ng/mL）。

在實際應用中，我們應當對需要檢測HCP的所有樣品類型（包括過程樣品以及最終的藥物原液）進行稀釋線性的評估，并將每種樣品類型和基質的MRD值以及稀釋不同樣品的具體指導納入到SOP文件中。

稀釋線性不佳的原因與解決方法

對于HCP ELISA檢測，可能會出現某些HCPs稀釋線性不佳的情況，也就是樣品中存在某些HCPs的抗體過剩條件未被滿足。例如，個別高濃度的HCP可能對該特定HCP的抗體產生飽和，出現了“鉤子效應（high-dose hook effect）”，從而導致該HCP的定量不準確。

圖2 鉤子效應（high-dose hook effect）示意圖

此外，某些伴隨蛋白（hitchhiker proteins）可能會與產物蛋白相互作用，并在純化過程中顯著富集，從而完全干擾整個分析的線性。

圖3. 伴隨蛋白（hitchhiker proteins）與產物蛋白相互作用干擾分析線性

其他導致稀釋線性不佳的原因還有可能是產品配方（或過程樣品的緩沖溶液）中的某些成分干擾了檢測，對于Cygnus HCP ELISA試劑盒，已知的干擾因素包括極端pH、洗滌劑、有機溶劑、高蛋白濃度和高鹽濃度等，因此我們建議樣品的稀釋一定要使用和標準品相同的稀釋液，詳見下表。

Cygnus不同生物工藝雜質檢測試劑盒對應的樣品稀釋液一覽

最后，我們再次強調，只有在抗體過剩的情況下，劑量反應曲線才會呈正斜率，檢測結果才是準確的。

如果稀釋線性不佳的因素是由HCP抗體不足或樣品基質干擾，那么隨著樣品的稀釋倍數增加，其測得的HCP濃度會呈現上升趨勢，因此需要通過進一步稀釋樣品來達到MRD。如果是其他原因，也可以通過優化實驗步驟來提高檢測的準確性。如果增加樣品的稀釋倍數仍無法解決稀釋線性不佳的問題，則有可能是純化過程存在問題。

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